Pectobacterium carotovorum – Mokra zgnilizna cukinii.

Występowanie i zakres gospodarzy

Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (Pcc) (dawniej Erwinia carotovora subsp. carotovora) (Snijder i Van Tuyl 2002) występuje powszechnie i jest patogenem odpowiedzialnym za wywoływanie mokrej zgnilizny. Infekcja wywoływana przez te bakterie prowadzi zwykle do rozległej maceracji i gnicia tkanek parenchymatycznych zainfekowanych organów, w związku z produkcją dużych ilości proteaz i enzymów pektynolitycznych (Kotoujansky 1987).

Rozprzestrzenianie

Pectobacterium carotovorum, podobnie jaki większość bakterii fitopatogenicznych, przenosi się z rośliny na roślinę wraz z kroplami wody i wnika do jej wnętrza poprzez uszkodzenia mechaniczne epidermy. Jej rozwojowi sprzyja występowanie obfitych deszczy i wysokich temperatur. W takich warunkach klimatycznych zaobserwowano masowe występowanie masowe występowanie mokrej zgnilizny na łodygach cukinii prowadzące do znacznego obniżenia plonów.

Szkodliwość

Objawy choroby nasilają się w temperaturach 25–30°C (Pérombelon i Salmond 1995). Miękka mokra zgnilizna powoduje większe straty w produkcji niż jakiekolwiek inne choroby bakteryjne (Bhat i wsp. 2010). O jej szkodliwości decyduje brak skutecznej metody ochrony oraz szybkość rozprzestrzeniania się na plantacji (Wright i wsp. 2002). Brak jest doniesień o możliwości stosowania środków ochrony roślin hamujących rozwój chorób bakteryjnych w uprawie polowej cukinii. Asortyment chemicznych środków ochrony roślin jest bardzo niewielki i ograniczony prawie wyłącznie do środków miedziowych (Mikiciński i wsp. 2010). Mają one zastosowanie jedynie w uprawach szklarniowych. Środki ochrony roślin na bazie związków miedzi hamują wzrost bakterii Pcc przy różnych koncentracjach jonów miedziowych, ale efektywność tych preparatów jest zredukowana przez obecność jonów fosfatowych w pożywce stosowanej w uprawie (Gracia-Garza i wsp. 2002).

Wykrywanie i identyfikacja

Bakterie izolowano z roślin cukinii z uprawy polowej. Po przemyciu sterylną wodą destylowaną, fragmentów łodyg wykazujących objawy mokrej zgnilizny, za pomocą sterylnego skalpela wycinano fragmenty z pogranicza miedzy chorą i zdrową tkanką, które następnie macerowane były w sterylnym moździerzu. Otrzymany homogenizat po rozcieńczeniu sterylną wodą destylowaną przenoszony był ezą na podłoże TSA (Tryptic Soy Agar MP Biomedicals, zawierającej 1% v/v glicerolu). Po wykonaniu posiewu redukcyjnego, szalki inkubowano w temperaturze 25°C. Po upływie 48 godzin obserwowano wzrost kolonii bakteryjnych. Wyodrębniono cztery morfotypy bakterii, dla których następnie zostały przeprowadzone testy patogeniczności. Owoce cukinii i ogórka zdezynfekowano powierzchniowo 70% etanolem, pokrojono na plasterki i ułożono w sterylnych szalkach Petriego, do których wlano pipetą po 5 ml sterylnej wody destylowanej. Na tak przygotowane fragmenty warzyw nanoszono po kropli zawiesiny bakteryjnej każdego z badanych izolatów o koncentracji bakterii 10⁸ cfu/ml. Kontrolę stanowiła sterylna woda destylowana. Szalki inkubowano w temperaturze 27°C przez 24 godzin. W celu spełnienia postulatów Kocha, z fragmentów roślin wykazujących objawy mokrej zgnilizny, reizolowano bakterie na pożywkę TSA. Badano aktywność pektynolityczną bakterii, sprawdzając zdolność wytwarzania przez bakterie enzymów pektynolitycznych na pożywce CVP (Crystal Violet Pectate Medium, Cupples i Kelman 1974). Powstawanie charakterystycznych zagłębień wokół kolonii bakteryjnych po 48 godz. inkubacji w temperaturze 27°C było wskaźnikiem aktywności pektynolitycznej izolatów. Zbadano gramowość bakterii stosując barwienie Grama z modyfikacją wg Reed, wytwarzanie fluoryzującego pigmentu na podłożu Kinga B, obecność oksydazy, katalazy, metabolizm glukozy w warunkach beztlenowych (O/F) w podłożu Hugh i Leifson. Sprawdzono zdolność do wytwarzania lewanu z sacharozy, hydrolizy żelatyny, redukcji azotanów, wytwarzania dihydrolazy z argininy oraz kwasu z glukozy, laktozy, mannitolu i sorbitolu. Wykonano test Vogesa-Proskauera (Schaad i wsp. 2001). Za pomocą systemu BIOLOG, określono możliwość utylizacji różnych źródeł węgla stosując płytki GN2 dla izolatów C1 i C3 oraz GP2 dla izolatu C2. Wyniki porównano z bazą danych MicroLog System 2 database 4.01B (Biolog, Inc., Hayward, Calif.). Przy użyciu starterów 16S04 i ph2 (Edwards i wsp. 1989) amplifikowano fragment genu kodującego 16S rRNA każdego z identyfikowanych izolatów bakteryjnych uzyskane produkty reakcji o długości 600 nt zostały zsekwencjonowane. Otrzymane sekwencje porównywano z sekwencjami zdeponowanymi w bazie Banku Genów za pomocą algorytmu Blast.

Z łodyg cukinii wykazujących objawy mokrej zgnilizny wyizolowano na podłoże TSA 4 morfotypy bakterii. W wyniku testów patogeniczności wyselekcjonowano 3 izolaty wywołujące mokrą zgniliznę tkanek. Izolaty pozyskane w roku 2009 oznaczono jako C1, C2 , izolat z roku 2010 jako C3. Po reizolacji bakterii na podłoże TSA otrzymano kolonie bakteryjne odpowiadające wyglądem w/w izolatom. Wykonano szereg testów identyfikacyjnych (tab. 1). Izolaty C1 i C3 wybarwiały się gram-ujemnie, izolat C2 gram-dodatnio, żaden z izolatów nie wytwarzał fluorescencyjnego barwnika na podłożu Kinga B, tylko izolaty C1 i C3 metabolizowały glukozę w warunkach beztlenowych (test O/F), izolat C3 bardzo silnie degradował kwas poligalakturonowy, co uwidaczniało się poprzez powstawanie charakterystycznych zagłębień w podłożu CVP (Tab. 1.)

Tabela 1. Cechy fenotypowe bakterii wyizolowanych z łodygi cukinii

Izolat Badana cecha	C1	C2	C3
Barwienie Grama	-	+	-
Obecność przetrwalników	-	-	-
Fluoryzujący pigment na podłożu KB	-	-	-
Metabolizm (O/F)	+	-	+
Redukcja azotanów	+	-	+
Hydroliza argininy	-	nb *	-
Wytwarzanie acetoiny (test Vogesa-Proskauera)	+	nb	-
Hydroliza żelatyny	-	-	+
Lewan	-	nb	-
Wytwarzanie kwasu z: Glukozy Mannitolu D-Sorbitolu D-Sacharozy	+ + + +	- - - -	+ + + +
Oksydaza	-	-	-
Katalaza	+	+	+

Porównanie otrzymanych fragmentów sekwencji 16S rDNA z analogicznymi sekwencjami w bazie danych Banku Genów wykazało, że sekwencja DNA izolatu C1 wykazuje 98% podobieństwo do sekwencji bakterii z rodzaju Erwinia, sekwencja izolatu C3 – 98% podobieństwo do podgatunku P. carotovorum ssp. carotovorum, izolat C2 – 99% podobieństwo do rzędu Acinetobacter. Identyfikacja przeprowadzona z użyciem systemu BIOLOG wykazała 100% podobieństwo izolatów C1 i C3 do podgatunku P. carotovorum ssp. carotovorum oraz 94% podobieństwo izolatu C2 do rodzaju Corynebacterium. W wyniku wszystkich przeprowadzonych badań ustalono, że izolaty C1 i C3, które przeważały w badanej florze bakteryjnej należą do podgatunku P. carotovorum ssp. carotovorum, a izolat C2 do rodzaju Corynebacterium. W testach patogeniczności wykazano, że bakterie z rodzaju Corynebacterium w sprzyjających warunkach, również powodują mokrą zgniliznę.

Literatura

Bhat N.A., Bhat S.D., Masoodi S.A., Mir M.Y., Zargar P., Sheikh A. 2010. Studies on status and host range of soft rot disease of cabbage (Brassica oleracea var. capitata) in Kashmir Valley J. Phytology 2 (10): 55–59. www.journal-phytology.com: 2075–6240.

Edwards U., Rogall T., Blöcker H., Emde M., Böttger E.C. 1989. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes. Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA. Nucleic Acids Res. 17: 7843–7853.

Cupples D., Kelman A. 1974. Evaluation of selective media for isolation of soft-rot bacteria from soil and plant tissue. Phytopathology 64: 468–475.

Gracia-Garza J.A., Blom T.J., Brown W., Allen W. 2002. Pre- and post-plant applications of copper-based compounds to control Erwinia soft rot of calla lilies. Can. J. Plant Pathol. 24: 274–280.

Kotoujansky A. 1987. Molecular genetics of pathogenesis by soft rot Erwinia. Ann. Rev. Phytopathol. 25: 405–430. 1154 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 51 (3) 2011

Mikiciński A., Sobiczewski P., Berczyński S. 2010. Nowe możliwości biologicznej i chemicznej ochrony roślin przed zarazą ogniową (Erwinia amylovora). Prog. Plant Protection/Post. Ochr. Roślin 50 (3): 1347–1351.

Pérombelon M.C.M., Salmond G.P.C. 1995. Bacterial soft rots. p. 1–20. In: „Pathogenesis and Host Specificity in Plant Diseases” Vol. 3 (R.P. Singh, ed.). Elsevier Science, Oxford, 417 pp. Schaad N.W., Jones J.B., Chun W. 2001. Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria. 3rd ed. The APS, St. Paul, MN, pp. 371.

Snijder R.C., Van Tuyl J.M. 2002. Evaluation of test of determine resistance of Zantedeschia spp. (Araceae) to soft rot caused by Erwinia carotovora subsp. carotovora. Eur. J. Plant Pathol. 108: 565–571.

Wright P.J., Burge G.K., Triggs C.M. 2002. Effects of cessation of irrigation and time of lifting of tubers on bacterial soft rot of calla (Zantedeschia spp.) tubers. N.Z. J. Crop Hort. Sci. 30: 265–272.