2015-09-21

Metoda biologiczna

Niska koncentracja wirusa w roślinie powoduje, że nie zawsze można go wykryć bezpośrednio w porażonej roślinie. Dlatego też, z młodych części roślin pobiera się materiał roślinny, którym w warunkach szklarniowych zakaża się zestaw roślin testowych (wskaźnikowych). Taki podstawowy zestaw to:

  • fasola zwyczajna (Phaseolus vulgaris)
  • groch siewny (Pisum sativum)
  • tytonie (Nicotiana tabacum) odm. Xanthi nc i Samsun,
  • komosa ryżowa (Chenopodium quinoa)
  • pomidor (Solanum lycopersicum)
  • ogórek (Cucumis sativus)

Liście rozciera się w moździerzu w niewielkiej ilości 0,05M buforu fosforanowego i tak przygotowanym inokulum zakaża się zestawu roślin testowych poprzez pocieranie liści palcem maczanym w soku roślinnym. Rośliny wskaźnikowe przed inokulacją opyla się karborundem, który pozwala na delikatne uszkodzenie tkanki liściowej, dzięki czemu rośliny łatwiej ulegają zakażeniu. Po 10 minutach nadmiar inokulum z liści spłukuje się wodą.

Począwszy od trzeciego dnia od dnia inokulacji, przez około 2-3 tygodnie przeprowadza się rejestrację pojawiających się na liściach objawów chorobowych. Z roślin wykazujących objawy infekcji wirusowych wykonuje się testy diagnostyczne, serologiczne i molekularne.

Przykładowe objawy infekcji wirusowej na roślinach:

    

Fig. 1. Lokalne nekrotyczne pierścionki na tytoniu            Fig. 2. Lokalne nekrozy na fasoli

      

Fig. 3. Systemiczna mozaika na ogórku                    Fig. 4. Systemiczne nekrozy na komosie białej

Do metod biologicznych stosowanych w badaniach bakteriologicznych zaliczamy testy patogeniczności i reakcje nadwrażliwości.

Do testów patogeniczności używa się roślin takiego gatunku z jakiego wyizolowano badane patogeny. Rośliny inokuluje się zawiesiną 24 godzinnej hodowli bakteryjnej poprzez opryskiwanie liści, wstrzykiwanie zawiesiny w łodygi lub nanoszenie zawiesiny na przerwane tkanki. Warunkami sprzyjającymi zajściu infekcji są podwyższona temperatura 26-27°C i wysoka wilgotność. Objawy chorobowe obserwuje się zwykle po 7 dniach. Pozytywny wynik tego testu, w postaci podobnych objawów chorobowych, oznacza spełnienie trzeciego postulatu Kocha, co uprawnia nas do stwierdzenia, że mamy do czynienia z właściwym czynnikiem chorobotwórczym.

 

Fig.5. Przykład testu patogeniczności na pomidorze.

Reakcja nadwrażliwości (ang. Hypersensitive Response) to wynik interakcji roślina-patogen gdzie śmierć komórki gospodarza, w większości przypadków manifestowana jest szybką destrukcją tkanki. Lokalnie występująca reakcja nadwrażliwości często wiąże się z początkiem systemicznej odporności nabytej (SAR) w oddalonych tkankach roślinnych. Reakcja nadwrażliwości może być specyficzna dla danego podgatunku bakterii jak ma to miejsce w przypadku bakteryjnego raka pomidora (Clavibacter michiganensis ssp. michiganensis). Inne podgatunki tej bakterii np. sepedonicus lub insidiosus nie wywołują reakcji nadwrażliwości na roślinie dziwaczka (Mirabilis jalapa). HR jest nieocenioną metodą rozpoznawania fitopatogenicznych bakterii stosowaną również w Klinice Chorób Roślin.

 

Fig.6. Reakcja nadwrażliwości na dziwaczku (Mirabilis jalapa).       

IMG_0671-Rys A  CH3-K B

Fig.7 Przykład objawów chorobowych na kukurydzy wywołanych przez badane izolaty. A-badany izolat M433, B-kontrola pozytywna Dickeya zeae (CH3)

Często wykonywanym testem patogeniczności jest tzw. test nadwrażliwości na tytoniu. Po wstrzyknięciu w roślinę zawiesiny bakteryjnej patogena (107 jtk/ml) obserwowuje się obajwy wystąpienia reakcji nadwrażliwości do 24 godzin po infiltracji.

IMG_6327-HR-129A163-6339_IMG-HR-Ecc270B

Fig.8 Przykłady reakcji nadwrażliwości wywołane przez badane izolaty bakteryjne. A-badany izolat M129, B- kontrola pozytywna Pectobacterium. carotovorum subsp. carotovorum (Ecc270)