Pseudomonas sp. – Mokra zgnilizna roślin uprawnych

Występowanie i zakres gospodarzy

Bakterie z rodzaju Pseudomonas występują powszechnie występują na powierzchni korzeni i naziemnych części roślin, jako saprofity (Lelliot 1987). Nie wykazują wtedy zdolności do pektynolizy. Jednak w odpowiednich warunkach, np. podczas osłabienia roślin, mogą wywołać rozległą zgniliznę. Charakterystyczne objawy mokrej zgnilizny to maceracja i rozpad tkanki roślinnej pod wpływem enzymów pektynolitycznych wydzielanych przez te patogena do środowiska.

Rozprzestrzenianie:

Bakterie te przenoszone są z rośliny na roślinę najczęściej za pośrednictwem wody. Bakterie te nie wymagają uszkodzeń epidermy do wniknięcia do wnętrza roślin. Wytwarzając enzymy pektynolityczne rozpuszczają one tkanki roślinne, powodując mokrą zgniliznę i w ten sposób umożliwiając sobie dostęp do tkanek rośliny.

Szkodliwość:

Szkodliwość bakterii z rodzaju Pseudomonas powodujących mokrą zgniliznę jest wysoka głównie ze względu na fakt, że powodują one choroby roślin w przechowalniach.

Wykrywanie i identyfikacja

Wykrywano bakterie z rodzaju Pseudomonas o właściwościach pektynolitycznych, z roślin uprawnych tj. rzepaku i buraka, rosnących w polu oraz z warzyw dotkniętych mokrą zgnilizną po zbiorze. Przeprowadzono również ich charakterystykę gatunkową i oceniono patogeniczność uzyskanych izolatów. Bakterie izolowano z warzyw: ziemniaka, cebuli, marchwi, pora, pietruszki, selera, sałaty zwyczajnej, sałaty lodowej oraz roślin uprawnych, tj. z buraka cukrowego i rzepaku. Zainfekowany materiał pochodził z pól, od producentów warzyw lub z punktów sprzedaży warzyw, na terenie Wielkopolski. Bakterie izolowano według powszechnie stosowanej metodyki (Lelliot 1987; Schaad 2001). Wyszczególnione morfotypy zaliczano do grupy pektynolitycznych Pseudomonas na podstawie tworzenia przez izolat zagłębień na pożywce CVP (Crystal Violete Pectate), sprawdzającej zdolność tworzenia enzymów pektynolitycznych oraz na podstawie wydzielania barwnika fluorescencyjnego na pożywce Kinga B (Schaad 2001). Tak oznaczone szczepy bakterii, identyfikowano do gatunku i biovaru za pomocą dalszych testów biochemiczno-fizjologicznych. Szczepy testowano pod kątem ich zdolności do: wytwarzania hydrolazy argininy, tworzenia lewanu, produkcji oksydazy, redukcji azotanów, upłynniania żelatyny, utylizacji sacharozy do kwasu organicznego oraz wywoływania reakcji nadwrażliwości na tytoniu. Wybrane izolaty testowano za pomocą testów API NE.

Patogeniczność bakterii badano metodą inokulacji bulw ziemniaka, zawiesiną bakteryjną o gęstości optycznej 1,4–1,6 w skali McFarlanda, co odpowiadało stężeniu 10⁹ jednostek tworzących kolonie na 1 ml sterylnej wody destylowanej. Umyte bulwy ziemniaka, sterylizowano powierzchniowo, zanurzając na 30 min w 0,5% roztworze podchlorynu sodu (Łojkowska 1987). Bulwy zakażano przez nakłuwanie ich końcówkami do pipet, zawierającymi po 100 μl zawiesiny bakteryjnej. Inokulację wykonano w dwóch powtórzeniach, na odmianie ziemniaka Hermes i Nicola, wkłuwając po 3 tipsy z zawiesiną badanego szczepu i jeden tips zawierający sterylną wodę, jako kontrolę negatywną. Zakażony materiał umieszczono w komorach o wysokiej wilgotności powietrza, w temperaturze 23–24ºC i inkubowano przez 7 dni. Skalę porażenia roślin oceniono na podstawie średnicy plamy gnilnej po podłużnym przekrojeniu, w miejscu wkłucia tipsa. Do obliczenia stopnia porażenia posłużono się pięciostopniową skalą punktową:

0 pkt – brak infekcji,

1 pkt – zgnilizna o średnicy od 0,1–1 cm,

2 pkt – zgnilizna o średnicy od 1,1–2 cm,

3 pkt – zgnilizna o średnicy od 2,1–3 cm,

4 pkt – zgnilizna o średnicy powyżej 3 cm.

Ogólny stopień porażenia obliczono wg wzoru Townsenda i Heubergera (Wenzel 1948):

P (%) = Σ (n × v) 100/4N

gdzie:

P – ogólny stopień porażenia bulw w kombinacji,

v – poszczególne stopnie porażenia wg skali 0–4,

n – liczebność bulw w poszczególnych stopniach porażenia,

N – ogólna liczba bulw wziętych do oceny w danej kombinacji,

4 – najwyższy stopień porażenia.

Wybrane izolaty testowano także na plastrach bulw ziemniaka, nakrapiając 50 μl zawiesiny bakteryjnej do wydrążonego w tkance zagłębienia. Warunki inkubacji były takie jak powyżej. Stopień porażenia odczytywano po 5 dniach.

W ramach badań wyizolowano 72 szczepy bakterii z grupy pektynolitycznych Pseudomonas, w tym: 26 izolatów P. viridiflava, 25 izolatów P. fluorescens, różnych biovarów i 21 izolatów P. marginalis (zaliczanego czasem do P. fluorescens b. II). Najliczniej występującym reprezentantem rodzaju Pseudomonas o właściwościach pektynolitycznych na terenie Wielkopolski, okazał się P. viridiflava (Tab. 1). Dominował on wśród izolatów pozyskanych z roślin uprawnych (burak, rzepak), gdzie stanowił 56,75%. P. marginalis był drugim co do liczności gatunkiem i przeważał w grupie izolatów pochodzących z warzyw (50%). Zidentyfikowano tylko jeden szczep gatunku P. putida. Wyniki te różnią się od uzyskanych wcześniej w Zakładzie Wirusologii i Bakteriologii (Żołobowska i Pospieszny 1999, 2001), gdzie struktura populacji pektynolitycznych Pseudomonas przedstawiała się następująco: P. fluorescens b. V 31,9%, P. marginalis 26,7%, P. putida 26,7% i P. viridiflava 3,3%. Różnice te mogą wynikać z tego, że w tych badaniach, izolaty pozyskano z porażonych organów spichrzowych, natomiast w naszej pracy, próby, w dużej mierze, stanowiły porażone liście, a więc naziemne części roślin. Wszystkie szczepy P. viridiflava wyizolowano z nadgniłych liści, co świadczy o preferencji tego gatunku do porażania tych części roślin.

Tabela 1. Struktura populacji bakterii z grupy pektynolitycznych Pseudomonas występujących na terenie Wielkopolski

Gatunek bakterii	Udział w populacji zebranych izolatów (%)
P. viridiflava	36
P. marginalis (P. fluorescens b. II)	29
P. fluorescens b. I	15,3
P. fluorescens b. V	11
P. fluorescens b. III	8,3

Najbardziej patogenicznym gatunkiem z grupy pektynolitycznych Pseudomonas był P. marginalis. Szczegółowe dane przedstawia tabela 2. Izolaty uzyskane z warzyw były bardziej patogeniczne (16,26%) od tych pochodzących z roślin uprawnych – burak, rzepak (10,97%). Wyniki badań wskazują na rolę dostępności tlenu w rozwoju mokrej zgnilizny wywołanej przez bakterie z grupy pektynolitycznych Pseudomonas. W teście patogeniczności z wykorzystaniem plastrów ziemniaka uzyskano znacznie rozleglejszą macerację tkanki niż przy zastosowaniu metody nakłuwania. Często izolat, który wywoływał proces gnilny na pociętej bulwie ziemniaka, nie powodował gnicia po zainokulowaniu zawiesiny, za pomocą tipsa, do całej bulwy.

Tabela 2. Porównanie patogeniczności bakterii z grupy pektynolitycznych Pseudomonas występujących na terenie Wielkopolski.

Gatunek bakterii	Średnia wartość stopnia porażenia P bulw ziemniaka odmiany Nicola (%)	Średnia wartość stopnia porażenia P bulw ziemniaka odmiany Hermes (%)
P. marginalis (P. fluorescens b. II)	21,52	22,05
P. fluorescens b. I	11,66	18,18
P. viridiflava	10,93	14,58
P. fluorescens b. V	5,20	8,33
P. fluorescens b. III	4,16	–

Literatura

Godfrey S.A.C., Marshall J.W. 2002. Identification of cold-tolerant Pseudomonas viridiflava andP. marginalis causing severe carrot postharvest bacterial soft rot during refrigerated export from New Zealand. Plant Pathol. 51: 155–162.

Lelliott R.A., Stead D.E. 1987. Methods for the Diagnosis of Bacterial Diseases of Plants. Blackwell Scientific Publications, London, 216 ss.

Liao C.-H., McCallus D.E., Wells J.M. 1993. Calcium-Dependent Pectate Lyase Production In the Soft-Rotting Bacterium Pseudomonas fluorescens. Postharvest Pathology and Mycotoxins 83 (8): 813–817.

Łojkowska E. 1991. Mieszańce somatyczne Solanum tuberosum i Solanum brevidens jako źródło odporności bulw ziemniaka na mokrą zgniliznę; analiza czynników warunkujących odporność bulw na degradację przez bakterie z rodzaju Erwinia. Rozprawa habilitacyjna, Bonin, 91 ss.

Schaad N.W., Jones J.B, Chun W. 2001. Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria. The APS, St. Paul, 373 ss.

Wenzel H. 1948. Zur Erfassung des Schadenausmasses in Planzenschutzsversuchen. Pflanzenschutzberichte 15: 81–84.

Żołobowska L., Pospieszny H. 1999. Gatunki bakterii z rodzaju Pseudomonas stowarzyszone z mokrą zgnilizną roślin w Polsce. Prog. Plant Protection/Post. Ochr. Roślin 39 (1): 148–153.

Żołobowska L., Pospieszny H. 2001. Diversity of Pseudomonas species associated with soft rot of plants in Poland. J. Plant Protection Res. 41: 67–76.