2015-05-11

Enterobacter cloaceae subsp. dissolvens- bakteryjna zgnilizna łodygi kukurydzy (ang. bacterial stalk rot)

Enterobacter cloaceae subsp. dissolvens- bakteryjna zgnilizna łodygi kukurydzy (ang. bacterial stalk rot)

Występowanie i zakres gospodarzy

E. cloaceae subsp. dissolvens należy do złożonego kompleksu gatunków. Gatunek ten wykorzystuje się do biologicznej ochrony roślin przed chorobami. Jest on również patogenem kukurydzy, sorga, cebuli, ryżu, fasoli i papaji. Na kukurydzy E. cloaceae subsp. dissolvens powoduje bakteryjne gnicie łodygi.

Fig A Fig B

Fig. 1. Objawy chorobowe na kukurydzy cukrowej porażonej przez bakterię E. cloaceae subsp. dissolvens w warunkach polowych. A - miejscowe gnicie łodygi, B - łodyga kukurydzy złamana w miejscu infekcji.

Identyfikacja

Bakterie wyizolowane z roślin wykazujących opisane wyżej objawy były identyfikowane przy użyciu różnych technik. Wstępną identyfikację do gatunku przeprowadzono przy użyciu testów API 20E. Wyniki tej identyfikacji potwierdzano następnie przy użyciu testu BIOLOG GEN III, który umożliwia analizę aż 95 cech biochemicznych badanego izolatu w ciągu doby, co czyni go efektywnym narzędziem diagnostycznym. Wynik tej identyfikacji przedstawia tabela 1.

Tab. 1. Identyfikacja wybranych izolatów bakteryjnych przy użyciu systemu BIOLOG.

Numer izolatu

Wynik identyfikacji przy użyciu sytemu BIOLOG

 

Parametry systemu BIOLOG

Prawdopodobieństwo (%)

Podobieństwo

Dystans

M277

Enterobacter cloaceae

98

0,677

4,74

M332

Enterobacter cloaceae

99

0,584

6,40

M354

Enterobacter cloaceae

98

0,645

5,27

M374

Enterobacter cloaceae

91

0,682

3,76

M380

Enterobacter cloaceae

98

0,500

7,79

M381

Enterobacter cloaceae

99

0,542

7,14

M425

Enterobacter cloaceae

99

0,621

5,80

M722

Enterobacter cloaceae

100

0,514

7,73

M940

Enterobacter cloaceae

100

0,666

5,10

Dodatkowo przeprowadzono również analizę filogenetyczną wybranych izolatów bakteryjnych należących do gatunków: P. ananatis, P. agglomerans i E. cloaceae subsp. dissolvens, w oparciu o sekwencję genu 16S rRNA (ok. 1500 pz). Do amplifikacji tego fragmentu genomu, używano równolegle 3 par starterów, których produkty PCR nakładają się na siebie (Fig. 2). Otrzymane produkty PCR oczyszczono i poddano sekwencjonowaniu.

16S-3pary-przyklad

Fig. 2. Produkty PCR trzech par starterów służących do namnażania 16S rDNA. Oznaczenia: Od lewej: linia 1 - marker DNA ØX174, linie 2 i 3 – produkt PCR pary starterów 16S01/pD2, linie 4 i 5 – produkt PCR pary starterów 16S02/pF2, linie 6 i 7 - produkt PCR pary starterów 16S04/pH2.

Bazując na uzyskanych sekwencjach nukleotydowych genu 16S rRNA wybranych izolatów oraz na analogicznych do nich sekwencjach pobranych z GenBanku, przeprowadzono analizę filogenetyczną (Rys. 3). Analizę przeprowadzono przy użyciu metody najbliższego sąsiada (ang. neighbor joining) w programie Mega 4.0. Jako wartość bootstrap przyjęto 1000 powtórzeń. Dane umożliwiające identyfikację izolatów są umieszczone na dendrogramie (Rys. 9 i 10). Sekwencje genu 16S rRNA, uzyskane dla wybranych izolatów, po analizie bioinformatycznej zamieszczono w bazie danych GenBank (Tab. 2).

Tab. 2. Uzyskane sekwencje genu 16S rDNA zamieszczone w bazie danych GenBank.

LP.

Izolat

Długość sekwencji nukleotydowej (pz)

Numer akcesyjny GenBanku

Gatunek

1.

ATCC 23373

1507

HQ651841

E. cloaceae subsp. dissolvens

2.

M277

1504

HQ651835

E. cloaceae subsp. dissolvens

3.

M332

1485

HQ651836

E. cloaceae subsp. dissolvens

4.

M354

1500

HQ651837

E. cloaceae subsp. dissolvens

5.

M380

1507

HQ651838

E. cloaceae subsp. dissolvens

6.

M381

1516

HQ651839

E. cloaceae subsp. dissolvens

7.

M425

1500

GU979185

E. cloaceae subsp. dissolvens

8.

M722

1521

GU979184

E. cloaceae subsp. dissolvens

9.

M940

1507

HQ651840

E. cloaceae subsp. dissolvens

 

Fig. 3. Dendrogram przedstawiający analizę 16S rRNA E. cloaceae subsp. dissolvens, skonstruowany metodą neighbor joining uwzględniający różne gatunki rodzaju Enterobacter oraz 1 sekwencję Pseudomonas syringae (DQ318866) użytą jako grupa zewnętrzna. Wartość bootstrap wynosiła 1000 powtórzeń. Badane izolaty E. cloaceae subsp. dissolvens (E. dissolvens) oznaczono na dendrogramie czarnymi kwadratami. Symbolu czarnego koła użyto do oznaczenia sekwencji innych izolatów E. cloaceae subsp. dissolvens oraz odwrócony, czarny trójkąt oznacza izolaty należące do gatunku E. cloaceae dostępne w GenBanku. Sekwencje szczepów wzorcowych (ang. type strains) każdego analizowanego gatunku oznaczone są literą: t (-T), za nazwą gatunkową.

Dodatkowo badano rolę pospolicie występujących chwastów polnych jako potencjalnego rezerwuaru dla bakterii E. cloaceae subsp. dissolvens. W wyniku sztucznej inokulacji w warunkach szklarniowych objawy infekcji bakteryjnej wykazały dwa gatunki chwastów: chwastnica jednorodna i palusznik krwawy. Porażały je dwa spośród 9 badanych izolatów E. cloaceae subsp. dissolvens, izolaty: M425 i M722. Bakterie reizolowane z roślin wykazujących objawy infekcji bakteryjnej, wykazywały identyczny profil biochemiczny w testach API 20E, jak izolaty, których użyto do zakażania, co jednoznacznie potwierdziło ich tożsamość. Uzyskane wyniki pozwalają na założenie, że w sprzyjających warunkach środowiskowych wybrane gatunki pospolicie występujących chwastów polnych mogą stanowić potencjalne siedlisko bakterii patogenicznych dla kukurydzy.